摘要：PCR實(shí)驗(yàn)，即臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段

 PCR實(shí)驗(yàn)，即臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，是專門用來檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。

而三級(jí)綜合醫(yī)院不具備核酸檢測(cè)能力的少之又少，大多已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了PCR實(shí)驗(yàn)的基本要求，差別只在于開展項(xiàng)目略有不同，這項(xiàng)要求真正難以落實(shí)的主要問題是：二級(jí)醫(yī)院/縣醫(yī)院建立PCR實(shí)驗(yàn)室不容易。

就新冠病毒核酸檢測(cè)來說，RT-PCR是目前使用廣泛和較準(zhǔn)確的篩選和確認(rèn)方法，大規(guī)模核酸檢測(cè)，必然會(huì)引起相關(guān)機(jī)構(gòu)單位著力建設(shè)規(guī)范的臨床PCR實(shí)驗(yàn)室。但是，建立一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)室，其實(shí)就是在建設(shè)一個(gè)平臺(tái)，考驗(yàn)的不僅僅是一個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)?zāi)芰?，也考?yàn)著整個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的整體能力。下面，筆者就為大家整理一下PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)及日常管理方面的一些問題。

 

一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是什么？

實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng) 系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞同一個(gè)核心問題進(jìn)行——“避免污染”，任何級(jí)別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室時(shí)，均需要提前考量各個(gè)因素，以保證標(biāo)本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)室的生物安全。

1、建設(shè)要求。PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的“四區(qū)”：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

2、人員要求。進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項(xiàng)等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。

3、檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產(chǎn)生氣溶膠，有感染的風(fēng)險(xiǎn)。

4、防護(hù)要求。必須按照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求進(jìn)行。

 

二、PCR實(shí)驗(yàn)的污染來源都有哪些？

1、樣本間交叉污染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)導(dǎo)致外溢；不同樣本移液時(shí)忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時(shí)消毒滅菌；不同樣本同時(shí)開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。

2、實(shí)驗(yàn)試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對(duì)照及其它試劑被核酸模板或陽(yáng)性對(duì)照污染。加樣過程中，因?yàn)镻CR試劑對(duì)溫度十分敏感，需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個(gè)過程也充滿污染風(fēng)險(xiǎn)。

3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是PCR反應(yīng)中主要、常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽(yáng)性。

4、克隆質(zhì)粒污染：作為陽(yáng)性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。

 

三、防止實(shí)驗(yàn)污染都有哪些措施？

對(duì)于低流行地區(qū)，PCR檢測(cè)人員經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)上崗后，核酸污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小，但在疫區(qū)超負(fù)荷工作時(shí)，就可能會(huì)遇到核酸污染的問題，可通過以下措施降低污染機(jī)會(huì)：

1、正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進(jìn)行開蓋操作時(shí)容易發(fā)生交叉污染。

2、正確使用生物安全柜：簡(jiǎn)單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時(shí)清理廢液缸，保證廢物不超過廢液缸體積的2/3。

3、核酸提取儀去污染：每天多批次檢測(cè)時(shí)，在每一批次檢測(cè)完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對(duì)儀器進(jìn)行去污染。

4、重視通風(fēng)：不定期對(duì)房間進(jìn)行通風(fēng)，每次至少持續(xù)30min。

5、PCR擴(kuò)增區(qū)去污染：PCR反應(yīng)管必須蓋緊，避免擴(kuò)增后的核酸對(duì)環(huán)境的污染。

6、實(shí)驗(yàn)室隨手可及的消毒劑。

 

四、PCR實(shí)驗(yàn)室的空氣流向管理與環(huán)境消毒？

前面提到，PCR實(shí)驗(yàn)室可分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)四個(gè)區(qū)域，這四個(gè)區(qū)域在物理空間上必須完全相互獨(dú)立，各區(qū)域無論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。所以，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)按：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)，應(yīng)時(shí)刻防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前區(qū)域。可按照上述順序區(qū)域空氣壓力遞減的方式進(jìn)行，也可通過安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行方式實(shí)現(xiàn)。

臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境清潔：《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》中有對(duì)物表清潔、消毒的要求，不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

（1）基本原則：由清潔區(qū)向污染區(qū)進(jìn)行，潔具不可交叉。

（2）清潔消毒方向：準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)。

（3）清潔消毒范圍：工作區(qū)域的物體表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒劑擦拭消毒，空氣和工作臺(tái)面可使用紫外線照射消毒，也可使用空間消毒器進(jìn)行全環(huán)節(jié)消毒。不可使用紫外線消毒器及化學(xué)消毒進(jìn)行有人狀態(tài)下的消毒。PCR室內(nèi)的消毒應(yīng)防止揚(yáng)塵（減少人員走動(dòng)）、殺滅DNA或RNA的基因片段。可選擇懸掛紫外線燈管進(jìn)行空氣消毒，試驗(yàn)前照射30-60分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)束照射30-60分鐘，必要時(shí)延長(zhǎng)照射時(shí)間（可照射一夜）。

（4）終末消毒：當(dāng)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)，應(yīng)按要求立即撤出相關(guān)人員，在無人情況下可使用化學(xué)消毒劑進(jìn)行終末消毒，如熏蒸法：過氧乙酸1g/ m³加熱熏蒸（濕度70-90%），密閉24小時(shí)；氣溶膠噴霧：3%過氧化氫：20mL/m³氣溶膠噴霧；5%過氧乙酸2.5mL/m³氣溶膠噴霧（濕度20-40%）。

 

五、日常清潔消毒應(yīng)該如何做？

1、每日工作前后，對(duì)工作區(qū)域表面、地面進(jìn)行清潔并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚(yáng)塵的方式進(jìn)行。

2、物品防塵存放。墻面定期清潔，有可見污染及時(shí)進(jìn)行清潔消毒。配備移動(dòng)紫外線消毒裝置進(jìn)行空氣和物表的消毒。

3、生物安全柜的消毒：

（1）每天工作前：對(duì)生物安全柜的內(nèi)表面進(jìn)行消毒，包括工作臺(tái)面和內(nèi)壁使用消毒劑擦拭；

（2）工作結(jié)束：柜內(nèi)物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺(tái)面四周、以及玻璃內(nèi)側(cè)燈部位；

（3）停用生物安全柜前：運(yùn)行5min以凈化內(nèi)部空氣；

（4）消毒劑應(yīng)選擇能夠殺死生物安全柜里可能發(fā)生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒劑）。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還應(yīng)用無菌水再次進(jìn)行擦拭；

（5）終末消毒：需要進(jìn)行終末消毒的時(shí)機(jī)。

 

六、試驗(yàn)完成后，物品及環(huán)境如何處理？

（1）做好廢液及固廢處理；

（2）實(shí)驗(yàn)室空間消毒：在室溫，50-60%濕度條件下，使用過氧乙酸熏蒸2g/m³，過夜；或使用20g/l氣溶膠噴霧，用量8g/m³；

（3）物體表面消毒液：0.55%含氯消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時(shí)內(nèi)使用。